摘要：
高等脊椎動物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因編碼，催化酪氨酸殘基去磷酸化，與其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同調節(jié)機體內多種信號通路的信號傳導。以往研究表明，SHP2在高等脊椎動物T細胞和B細胞的激活與信號轉導過程中起著重要作用。


蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases， PTPs)具有催化蛋白酪氨酸殘基去磷酸化的功能，與能夠催化蛋白酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases， PTKs)作用相反。在兩者的共同作用下，蛋白酪氨酸殘基發(fā)生可逆磷酸化，從而可以調節(jié)細胞膜酶聯(lián)受體的信號轉導，對生物的生長發(fā)育具有重要意義。研究表明PTKs主要與致癌和促腫瘤活性相關，而PTPs通常在各種人類腫瘤細胞中發(fā)生突變或異?；罨?/font>，表明其正常功能的維持會對腫瘤的發(fā)展起一定的抑制作用。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2是PTP家族中的一員，也是第一個被證實的原癌基因，廣泛表達于各種組織中，參與多種生物學信號的轉導，是脊椎動物發(fā)育中不可缺少的胞內非受體型PTP。人類SHP2蛋白由ptpn11基因編碼，其氨基酸序列具有一個N端Src同源2 (N-terminal Src homology 2， N-SH2)結構域、一個與N-SH2結構域相鄰的C-SH2結構域和一個跨度比較大的PTP結構域。在SHP2分子的C端有兩個磷酸化位點(Y542與Y580)和一個富含脯氨酸基序的尾部。N-SH2結構域是一種構象開關，在正常生理條件下，SHP2的N-SH2結構域與其自身的PTP結構域相結合，抑制其磷酸酶活性。然而，SHP2如果通過其SH2結構域與酪氨酸磷酸化生長因子受體或接頭蛋白結合則會導致這種分子內相互作用被破壞，使其PTP結構域上的催化活性中心暴露，從而激活其磷酸酶活性。通過串聯(lián)的SH2結構域識別雙磷酸化的配體是該開關的組成部分；而C端SH2結構域雖然有助于提高結合能和特異性，但它被激活后并不能直接起作用。

SHP2是一種分布廣泛的酪氨酸磷酸酶，作為轉導因子參與細胞內由各種生長因子、激素或細胞因子介導的重要的信號通路。如SHP2可以促進小GTP結合蛋白(Rat sarcoma， Ras)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)途徑激活，而Ras/MAPK通路對細胞的增殖、分化和凋亡起著重要作用。當細胞受到生長因子的刺激后，SHP2作為正調控因子促進受體酪氨酸激酶激活的下游細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases， Erk)/MAPK信號通路，也可以增強由細胞因子IL-21激活的細胞增殖過程中ERK1/2信號傳導活性。體外實驗證明，SHP2也能夠通過正向調控絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt (serine/threonine protein kinases Akt， Akt)和Erk1/2信號傳導促進少突膠質細胞的成熟。SHP2在導致Erk激活的各種促有絲分裂信號傳導途徑中起著正調控作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)SHP2在介導細胞外信號調節(jié)和下游c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases， JNK)信號通路的激活方面具有負調控作用。這也是酪氨酸磷酸酶SHP2在介導Erk和JNK、MAPK活化中具有負調控作用的第一個證據。另外，SHP2在高等動物適應性免疫系統(tǒng)的免疫應答反應中也發(fā)揮著重要作用。Hoff等發(fā)現(xiàn)SHP-2在T細胞受體(T cell receptor， TCR)介導的免疫反應中起重要作用，促進炎癥細胞因子的分泌、趨化因子誘導的遷移以及活化細胞的凋亡。

七鰓鰻(Petromyzoniformes)作為目前世界上僅存的最原始無頜類脊椎動物之一，承接了從無脊椎動物到脊椎動物的進化歷程，被稱為“活化石”。由于其在進化上的特殊地位，七鰓鰻成為研究脊椎動物起源與進化的關鍵物種。研究證明，在七鰓鰻體內不僅存在著先天性免疫，同時存在著適應性免疫，而七鰓鰻的適應性免疫不同于高等脊椎動物。高等脊椎動物的適應性免疫依賴于免疫球蛋白(Ig)及TCR和B細胞受體(BCR)分子介導，七鰓鰻的適應性免疫系統(tǒng)則是由可變淋巴受體(variable lymphocyte receptors， VLR)介導。在無頜類脊椎動物中，其適應性免疫系統(tǒng)中最顯著的特征是使用富含亮氨酸的重復模塊來組裝可變淋巴細胞受體基因(VLRA、VLR B和VLRC)。為了更加清晰地了解無頜類脊椎動物是否存在作為適應性免疫應答信號傳導的重要調控因子SHP2，本研究在日本七鰓鰻(Lampetra japonica)中克隆并鑒定了與高等脊椎動物SHP2同源的分子，研究SHP2在日本七鰓鰻免疫應答過程中的作用，揭示SHP2家族的系統(tǒng)發(fā)生，為探索高等脊椎動物適應性免疫系統(tǒng)的早期發(fā)生及其進化歷程提供一定的線索。

來自遼寧師范大學生命科學學院、大連工業(yè)大學的研究人員通過PCR 擴增獲取其Lja-SHP2開放閱讀框序列，并構建到原核表達載體 pET-32a中，成功在大腸桿菌中實現(xiàn)重組蛋白表達并制備了其兔源多克隆抗體。用混合菌免疫刺激日本七鰓鰻后，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡方法檢測了Lja-SHP2在日本七鰓鰻免疫相關組織中mRNA和蛋白水平表達譜。結果顯示，混合菌免疫刺激后，Lja-SHP2 mRNA和蛋白表達在外周血白細胞和髓樣小體中無顯著變化，而在鰓組織中顯著性上調(P<0.05)，說明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要參與了鰓組織的免疫應答反應。為了進一步探究Lja-SHP2與淋巴細胞亞群免疫應答反應的相關性，本研究分別使用B細胞有絲分裂原脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)和T細胞的有絲分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin， PHA)免疫刺激日本七鰓鰻。經LPS免疫刺激后，與對照組相比，白細胞中Lja-SHP2蛋白表達顯著上調，鰓組織和髓樣小體沒有顯著性差異表達;但經PHA免疫刺激后，與對照組相比，白細胞、鰓組織和髓樣小體3種組織中Lja-SHP2均有上調，尤其在白細胞中上調最為顯著，大約是對照組的2.5倍，說明Lja-SHP2參與了日本七鰓鰻由PHA介導的免疫應答反應。由于PHA能刺激日本七鰓鰻鰓組織中VLRA +淋巴細胞的活化，這表明Lja-SHP2可能參與了PHA介導的VLRA +淋巴細胞亞群的免疫應答反應。

SDS-PAGE檢測Lja-SHP2的重組表達、可溶性及純化結果

Lja-SHP2多克隆抗體效價與特異性檢測

 Lja-SHP2 mRNA和蛋白質在各免疫相關組織中的相對表達量

SHP2作為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，參與多條信號通路，如RAS/MAPK通路、PI3K/AKT通路及JAK/STAT通路等，不僅為脊椎動物胚胎發(fā)育所必需，而且也參與多種組織特異性細胞的增殖、分化和凋亡的調控。SHP2也是一種特殊的蛋白酪氨酸磷酸酶，它既可以作為正調節(jié)因子調節(jié)下游信號轉導通路，也可以在特定條件下發(fā)揮負調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常T細胞相比，在缺失ptpn11的T細胞中Erk激酶活化受到阻礙;表明SHP2通過調節(jié)Erk途徑促進TCR信號傳導，是pre-TCR和TCR促進T細胞成熟和增殖的常用信號傳感器。另外，SHP2通過介導T細胞發(fā)育和功能參與多種信號傳導途徑，可以調節(jié)細胞因子依賴性粒細胞生成，也是嗜酸性粒細胞分化的關鍵調節(jié)因子。